时空组学 | 生命科学领域第三次科技革命，正式启动！

人类社会每一次关键的发展都有赖于科学的进步。诺贝尔奖获得者悉尼·布伦纳曾称，科学的进步依赖于新技术、新发现和新想法，新技术优于新发现，新发现优于新想法。在生命科学领域，新技术和新工具的应用同样意义非凡，恰如此前显微镜之于细胞生物学，测序技术之于基因组学，我们有理由期待下一次技术更迭带来的巨变。

空间异质性是器官功能的关键特征，细胞的位置信息对细胞命运调控机制和细胞谱系发生过程的研究十分重要。因此，为了更好地了解细胞，有必要同时记录其转录异质性和空间坐标。通常，这种对转录表达进行定量的同时记录了空间坐标的技术，被称为“空间全转录组测序技术”。叠加不同时间点取样，此类技术就能为研究者提供时间及空间两个维度的信息，因此也被称为“时空组”技术。

2020年，“空间全转录组测序技术”被Nature Methods评为年度技术方法。2021年1月，华大Stereomics®技术研究内容在BioRxiv上进行了预印刊载[1]。该技术的诞生，突破了分辨率和检测组织大小的限制，成为全球唯一一项能同时实现“亚细胞级分辨率”和“厘米级全景视场”的原位捕获空间全转录组测序技术，并可以实现基因与影像同时分析。该技术首次实现生命全景时空分子图谱，有望带来生命科学领域第三次科技革命。

一、技术简介

华大自主研发的Stereomics®是一项实现超高通量、超高精度的全景式时空转录组技术，通过时空芯片（Stereo Chip）捕获组织中的mRNA，并通过空间条形码（Coordinate ID, CID）还原回空间位置，实现组织空间检测，为深入地了解细胞的基因表达及形态与局部环境之间的关系建立基础。

目前能同时获得空间和mRNA定量信息的技术依据通量主要分为两类，低通量时空组技术包括微解剖基因表达技术、原位杂交技术和原位测序技术，高通量时空组为基于空间条形码的技术，包括 Nanostring[2]、10x Visium[3]、Slide-seq V2[4]、Stereo-seq[1]、Seq-scope[5]、sci-Space[6]。

从技术特点上比较，低通量技术在准确性上有较大优势，但也存在一定限制，特别是能够检测的组织大小和单次检测基因数；而基于空间条形码的高通量技术在检测组织面积和基因数上有显著提升。

图1 技术发展进程

二、技术原理

Stereo-seq时空芯片（Stereo Chip）是用于mRNA定位的芯片，使用了与华大DNBSEQ技术相同的芯片加工工艺。时空芯片由布满了数十亿规则阵列排布的单链线球状DNA纳米球（DNA NanoBall，DNB）组成。DNB是以单链环状DNA为模板，经过滚环扩增（Rolling-Circle Replication，RCR）后的得到的产物，每个DNB直径为220nm，两个DNB中心点间距范围为500nm。通过DNBSEQ技术对固定在芯片上的DNB进行测序，得到Coordinate ID（CID）信息，CID与DNB坐标位置一一对应，可以通过建立CID与坐标位置的映射关系，将后续捕获到的mRNA还原其空间位置。对照关系保存在时空芯片CID-坐标位置对照文件中（Stereo Chip Mask文件）。DNB经Stereo-seq独有的生化方法合成携带CID的DNB后链接分子编码（Molecular ID，MID 用于区分不同转录本）和ployT，从而能捕获游离的mRNA。标准Stereo-seq文库的CID序列长度为25bp，MID长度为10bp（图3）。

图2 Stereo-seq 芯片制备及建库测序分析流程图[1]

该技术首先将含有随机条形码序列的DNB沉积到经光刻蚀刻的经修饰的芯片上（步骤1）。与基于珠子的方法相比，使用滚环扩增放大产生的标记为DNB的随机条形码取得更大的空间条形码池，同时保持序列保真度。然后对阵列进行显微照相，用引物孵育并测序，以获得包含每个蚀刻DNB的坐标编码（CID）的数据矩阵（步骤2）。通过与CID杂交，在每个点上连接分子编码（MID）和含有寡核苷酸的polyT序列（步骤3）。下一步包括组织polyA尾RNA的捕获，通过将新鲜组织的冷冻切片加载到芯片表面，然后进行固定、透化，最后进行逆转录和扩增（步骤4）。收集扩增后的cDNA，作为制备文库的模板，与CID一起进行测序（步骤5）。对测序数据进行计算分析，可以实现空间分辨的转录组学研究，其分辨率为220nm(spot 直径220nm，两个DNB中心点间距为500nm)，标准1*1cm芯片上包含4亿个DNB(步骤6)。

图3 Stereo-seq 标准文库结构

三、技术优势

作为国际领先的时空技术，相较于其他基于空间条形码的高通量时空组技术，华大Stereomics®在检测组织大小及分辨率等方面具有多项突破性技术优势。

1. 纳米级分辨率，可实现亚细胞级分子定位

Stereomics®技术的检测分辨率可达到220nm，能实现对单个细胞及分子信息进行空间定位和检测，例如小鼠脑组织的各分区检测；同时可以对超小组织进行高分辨率的检测，例如小鼠嗅球（直径1mm）。

图4 利用Stereomics®技术进行小鼠脑组织空间全转录组检测结果[1]

2. 厘米级全景视场，检测组织大小可以扩展到13cm*13cm

Stereomics®技术设计的常规芯片大小为1cm*1cm，可以用于检测面积大小为 1cm*1cm以内的组织面。除常规芯片外，Stereomics®技术可依据组织大小定制不同尺寸的芯片，最大可以检测13cm以内的组织，是目前为止可全基因组范围内检测转录本表达的检测组织面积最大的时空组技术。

图5 不同大小芯片示例

3. 物种组织不设限，人、动物及植物多覆盖

Stereomics®技术目前已研发了针对人、不同动物及植物的各部位组织器官的检测方法，完成了多种动植物的组织器官的研究，其中包括人的脑、甲状腺癌、鼻咽癌、淋巴结、肺癌、脂肪肝、结肠癌、宫颈癌等组织，小鼠的全脑、迷走神经复合体、脑前额叶、肝脏、肾脏、心脏、结肠、睾丸、卵巢、足垫等组织，以及大豆、果蝇、斑马鱼、蝾螈等物种。

图6 已完成的组织样本经验

4. 实验操作流程简单，从组织切片转化到待测序的文库仅需8h

组织切片铺贴到芯片后，将组织切片进行固定、透化、反转录及cDNA回收等实验过程简便易操作，整个流程耗时较短，当天可完成实验。

5. 智能云数据分析系统，可实现高通量大数据的多维分析

Stereomics®配套搭建了stereomap智能云系统，用户可自行登录系统进行空间数据分析及挖掘。

图7 stereomap智能云系统

6. 亿级原位信息可视化展示，全面呈递组织不同空间结构的分子信息

利用stereomap智能云系统可将形态学数据与获取的亿万级空间分子信息进行结合，通过研发的软件进行空间信息的可视化展示。

图8 小鼠胚胎形态学及空间可视化结果[1]

四、实验流程

华大Stereomics®空间全转录组测序技术实验操作流程简便易懂，详细流程如下：

图9 Stereomics®空间全转录组实验操作流程图

五、应用场景

细胞的空间位置就如同宇宙中行星的运行轨迹，对细胞、组织功能具有无可比拟的作用，同时基因表达的位置信息对于理解组织功能和病理变化具有重要的意义。

华大Stereomics®技术突破了传统技术的限制，可以真正实现对组织中的细胞进行空间定位同时检测其基因表达，可以实现将生命科学研究带入到时空时代，并可应用于肿瘤研究、免疫研究、发育生物学、脑神经学、病理研究等方面。华大在单细胞和时空组学方向的工具自主可控，未来将全面提升人类对生命的认知和推动疾病的重新定义。

图10 应用场景

参考文献：

1. Chen, A. et al. Large field of view-spatially resolved transcriptomics at nanoscale resolution. bioRxiv 2021.01.17.427004 (2021).

2.Geiss, G. K. et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat. Biotechnol. 26, 317–325 (2008).

3. Ståhl, P. L. et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science(80-. ). 353, 78–82 (2016).

4. Stickels, R. R. et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution

（转载自华大时空）